HPLC推进更好的分离

高效液相色谱HPLC)是一种广泛使用的技术,用于从非均相溶液中分离分子以进一步表征。HPLC通常在质谱法之前用于鉴定肽,蛋白质和其他分子。与传统HPLC相比,超高效液相色谱(UHPLC)可提供更好的分离度,更高的灵敏度和更快的分离时间,但也可以降低重现性。本文将重点介绍HPLC技术的**新进展及其向更大生物分子分离的扩展。

HPLC和UHPLC系统

“HPLC的一个关键属性是其强大的可靠性,研究人员可能更倾向于采用既定方法来提高分离度或缩短运行时间 - 特别是如果HPLC方案定义明确的话。”

“对仪器将执行他们希望系统执行的操作的信心**关重要,”Thermo Fisher Scientific的HPLC战略营销经理Evert-Jan Sneekes说。

虽然HPLC和UHPLC之间没有明确的分界线,但一个区别是柱内颗粒(所用树脂)的直径。通常,HPLC中使用的颗粒大于2μm,而亚2μm颗粒用于UHPLC。但由于粒子技术的**新进展和工具提供商认识到研究人员希望尽可能实现**佳分离 - 无论它被称为传统用途还是传统用途,这种区别已经模糊不清。工具供应商通过提供一系列具有不同粒径的色谱柱来协助研究人员,以满足不同的分析方式。例如,沃特世用于小分子分离的新型CORTECS C8和Phenyl色谱柱的固体核粒径为2.7μm(HPLC)和1.6μm(UHPLC)。同样,

沃特世的ACQUITY Arc系统专为希望获得更好,更快的HPLC分离但无法切换到UHPLC的研究人员而设计。“他们可能会受到监管限制,例如禁止他们升级到UHPLC,”沃特世公司离职营销**主管William Foley说。“Arc多流路径技术让他们运行HPLC方法,然后如果他们愿意,可以尝试使用低色散流路和更小的粒子色谱柱,探索UHPLC在灵敏度,分辨率和速度方面的优势来自Thermo Fisher Scientific 的新型Vanquish平台设计用于HPLC和UHPLC,易于使用。

精炼粒子技术

HPLC和UHPLC都继续受益于粒子技术的进步。熔融核,固体核和核 - 壳颗粒 - 由与多孔外层融合的固体核组成 - 通过减少穿过色谱柱的分子的扩散路径长度来提高效率,并且在较低的流速和压力下可以实现更好的分离。

GE医疗集团生命科学业务的研究主管ÅkeDanielsson表示,颗粒可能会继续发展,可能导致使用更大的颗粒进行UHPLC型分离,目前这些颗粒将用于HPLC(例如,大于2μm)。“然后,使用不需要很高耐压性的设备就可以实现超高分辨率的分离,”他说。

色谱柱选择性也在提高。例如,Sneekes说,这在表征生物制药方面特别有价值。可以使用多种类型的HPLC柱化学(单独或在混合模式柱中)用于分析肽序列,聚集体,电荷变体,完整结构和聚糖谱。Phenomenex凭借其扩展的Kinetex®核 - 壳HPLC / UHPLC柱系列,为反相LC提供了新的选择性。根据Phenomenex**营销经理Jeff Layne的说法,传统的五氟苯基(PFP)固定相 - 反相HPLC中传统C18相的替代品 - 与批次之间的重复性相悖。新的Kinetex F5阶段,使用专有方法构建,保留了PFP选择性和改善的重现性。此外,Kinetex EVO C18核壳相设计用于低pH和高pH值(pH 1**12)的稳定性,“[改进的]有机硅表面化学改善了基本分析物的分离和峰形, “莱恩说。

HPLC检测器的进展

HPLC检测器的进展也在不断涌现。Jasco的新4000系列HPLC / UHPLC产品包括一系列HPLC检测器,包括双波长UV,光电二极管阵列(PDA),折射率,圆二色性,旋光度和荧光检测器。Jasco还提供一种新的基于单四极杆质谱仪(MS)的检测器,用于质量确认。Jasco的区域色谱专家Tom DePhillipo表示,研究人员越来越关注更简单,更紧凑,更便宜的MS检测器而不是高性能MS系统。“许多以前无法负担质谱检测的实验室会选择不太灵敏的通用检测方法,如蒸发光散射检测(ELSD),带电气溶胶检测(CAD)或折射率,”DePhillipo说。“虽然这些类型的检测在分析和制备领域中发挥作用,

同样,沃特世提供ACQUITY QDa质量检测器,用于验证分析物的质量。“这对于质量控制实验室或者独立质谱系统可能超出要求的情况非常有用,”Foley说。沃特世还计划推出新版电导检测器(用于HPLC和UHPLC)和更新的电子产品。

分离较大的生物分子

HPLC**初被开发用于分离小分子; 蛋白质可能更具挑战性。较大的生物分子以比小分子更慢的速率扩散 - 并且也不能有效地分离,具有减小的粒度(即,小于2μm)。“较小的颗粒尺寸不会提高效率[与蛋白质分离],”Layne说。“这是仅以3.6微米颗粒形态提供Aeris®WIDEPORE介质的原因。”

另一方面,通过SEC分离蛋白质可以受益于亚2μm的颗粒,因为较慢的流速倾向于保持足够低的背压以用于大多数HPLC系统。Phenomenex**近发布了Yarra®1.8-μmSEC-X150色谱柱,用于SEC分离高达450 kDa的蛋白质。2016年春季,Phenomenex将发布用于分子量高达700 kDa的Yarra 1.8-μmSEC-X300色谱柱,如高分子量蛋白质聚集体和大型生物仿制药。此外,GE Healthcare的新型SEC色谱柱使用不同的基于琼脂糖的树脂来分离不同大小范围的蛋白质:Superdex 200增加10-kD**600-kD蛋白质的树脂; Superose 6增加5-kD**5,000-kD蛋白质的树脂; 和Superdex 75 增加3-kD**70-kD蛋白质的树脂(预计将于2016年春季发布)。

MilliporeSigma的BIOShell™柱状颗粒也是专为生物分子设计的,其孔径为400A,比传统色谱柱大。“我们以这种方式设计它,因为生物治疗药物变得越来越大,越来越复杂,”MilliporeSigma市场部经理Wayne Way说。“较大的孔径允许更好的色谱,因为大的生物分子不会吸附到色谱柱上,这有助于为药品提供更好的峰形。”BIOShell™还提供更专业的色谱柱,用于处理糖蛋白或生物治疗药物,如抗体 - 药物结合物。

Sneekes预计未来的进步将使HPLC和质谱联合起来更加紧密。“色谱分析不仅仅是分离 - 分析问题只有在检测到分析物后才能得到解决,”他说。随着HPLC和UHPLC每年的改进,更好的分离使得更容易检测这些分析物。