UHPLC:更好地解决更大的蛋白质问题

几十年来,高效液相色谱HPLC)已被用于分离和纯化分子。**近,开发了超高效液相色谱(UHPLC)以促进小分子的分离。由于更好的分离度和更快的运行时间,与HPLC相比,小分子的UHPLC在药物开发中发挥了重要作用。但随着蛋白质被开发为生物治疗药物,研究人员越来越关注UHPLC用于更大的分子。以下是有关科学家如何采用UHPLC方法利用该技术优势分析较大生物分子(如蛋白质)的**新信息。

关于蛋白质的UHPLC有什么'超'?

不幸的是,蛋白质并没有得到与小分子相同的UHPLC“哇”因子。蛋白质往往比小分子大得多,无论你受到什么样的压力或流速,它们的运动都受到扩散的限制。那么,就蛋白质分析而言,UHPLC到底有什么“超”呢?

当研究人员**将UHPLC用于小分子时,由此产生的峰分离得如此之好,以**于“它们可以驱动卡车通过它们,” Phenomenex核心产品经理Michael McGinley说。“通过使用更短的色谱柱和更快的流速和梯度,用户可以轻松地”交换“一些超出分辨率以减少运行时间。”因为蛋白质峰值几乎没有分离,所以通常不会显着缩短运行时间。然而,**近对蛋白质友好的适应性导致UHPLC可以提供更好的分辨率和更短的运行时间。

对于正在努力分离大蛋白质样抗体并且产生峰值谱的研究人员来说,更好的分辨率的前景是有吸引力的。例如,抗体中的单个氨基酸变化通常表示化学组成差异小于0.1%。将其与小肽中的单个氨基酸变化相比较,这可能表示化学组成差异的10%**20%变化。“当蛋白质开始变大时,将它们分开开始变得有点冒险,”麦金利说。“变化很快就会很难看到。”

生物相容系统

虽然UHPLC不让科学家们一直看到蛋白质之间的所有差异,但它可以使他们看到一些差异 - 例如,在大体形态,二硫化物异构体,脱氨和蛋白质折叠。蛋白质研究人员使用不同的色谱  模式来实现这一目标,例如反相(RPC),离子交换(IEX)和尺寸排阻(SEC)色谱。“含盐流动相,例如在IEX和SEC中使用,对不锈钢系统具有很强的腐蚀性,”安捷伦科技分析HPLC**产品经理Cornelia Vad说。具有极端pH值的溶剂也是如此。

为应对溶剂挑战,安捷伦科技公司提供1260生物惰性液相色谱系统,由溶剂输送系统中的耐腐蚀钛和样品流路中的100%无金属材料构成。其他供应商提供生物相容性,耐腐蚀系统,由生物相容性金属合金,钛和其他生物相容性材料制成。这些系统包括赛默飞世尔科技的Vanquish Flex UHPLC和沃特世的  ACQUITY UPLC  系统。

Thermo Fisher Scientific为其Vanquish Flex UHPLC系统增加了许多新功能,特别是改进了自动进样器和柱温箱中的温度控制功能。“为了成功地分离蛋白质中的细微变化,仪器需要通过在储存和分离过程中实现生物相容性和精确的温度控制来保护精致的蛋白质样品免受外部因素的影响,” Thermo Fisher的 HPLC战略营销经理Evert-Jan Sneekes说道。科学的。

使用UHPLC系统检测蛋白质时的另一个考虑因素是仪器分散。沃特斯**科学家Tom Wheat说:“当流动通过流路的各个部分时,分散是峰值体积的增加。” “随着峰值从色谱柱出来,它会变得像它一样窄。”更宽的峰意味着更低的分辨率,因此**小化色散是**关重要的。Wheat说**小化分散在SEC和RPC色谱柱中尤其重要,但在IEX色谱柱中则不那么重要。Sigma-Aldrich生物分离产品经理Stacy Squillario补充说,仪器分散应“保持在**低水平,以**大限度地提高色谱性能。”

尽管GE Healthcare Life Sciences没有专用的UHPLC系统,但其预填充色谱柱系列,以及 用于中压液相色谱的ÄKTA™平台及其用于SEC的新增量色谱柱均设计用于蛋白质分离。小分子UHPLC主要使用RPC柱开发,但与蛋白质一起使用通常需要使用其他技术。“例如,SEC,亲和层析和IEX等技术对蛋白质的使用频率远高于RPC,”GE医疗集团生命科学业务研发,研究和应用市场研究主管ÅkeDanielsson说。

与质谱仪集成

许多蛋白质研究人员在质谱(MS)分析之前使用UHPLC分离蛋白质。这可以很好地工作,这取决于UHPLC分析的模式。“对于使用RPC的肽分离,在线分析[到MS]之前的清理工作已得到很好的发展,但对其他蛋白质分离的开发效果不佳,”Danielsson说。“MS与常用缓冲液和用于非RPC蛋白质分离的盐的相容性仍然存在问题。”

一些UHPLC系统设计用于与下游MS系统集成。Thermo Fisher Scientific的UHPLC系统与其Orbitrap MS仪器集成,Agilent的UHPLC系统与其Q-TOF系统和三重四极杆MS系统集成。Wheat说,沃特世的UHPLC系统可以与许多MS仪器一起使用,“取决于规模和应用。”他补充说,大多数集成问题“随软件提供”,因此检查MS和UHPLC系统的软件是否明智兼容。

改进的粒子技术

通常,用于小分子的UHPLC的定义特征是直径小于2微米的全多孔颗粒柱。然而,这些对于较大的蛋白质不起作用,因为它们可能导致背压增加,色谱柱堵塞和其他仪器维护问题。核 - 壳颗粒(也称为表面多孔,几何结构,熔融芯或混合颗粒),由多孔外层包围的固体球形内层制成,是**近的创新,可提供UHPLC的分离效率。使用较大的蛋白质 - 没有相关的问题。

由于几个原因,核 - 壳颗粒对蛋白质更有效。多孔壳减少了蛋白质进出颗粒所带来的扩散路径,因此峰宽往往更窄。“扩散对生物分子起着非常重要的作用,核壳材料具有优势,”麦金利说。“您可以**大限度地减少扩散路径,通过这样做可以获得更高的性能。”核 - 壳颗粒往往更大,从而降低系统背压并延长色谱柱寿命。“当我们进行蛋白质分离时,我们肯定不会遇到类似高压的事情,”Wheat说。“随着大分子缓慢扩散,你**好的分离是混合粒子的较低流速。”

一些供应商提供核 - 壳颗粒或色谱柱用于蛋白质分离。产品包括安捷伦的Poroshell  颗粒,Phenomenex的Aeris™WIDEPORE  核壳柱,Sigma-Aldrich的BIOshell™蛋白柱,Thermo Fisher Scientific的Accucore™  颗粒和Waters的CORTECS®颗粒。

今天和未来的应用

UHPLC的应用范围正在扩大,并且越来越多地包括生物治疗药物。McGinley说Phenomenex的核壳颗粒通常用于分离免疫球蛋白,“通常是IgG治疗药物,这些药物目前是蛋白质治疗工作的**大份额。”Vad说,安捷伦**新的一个专栏是“ AdvanceBio mAb反相色谱柱”。完整的抗体及其片段,也用反相进行分析。“

另一种UHPLC应用是糖蛋白的聚糖分析。沃特世**近发布了新的UHPLC和UHPLC-MS分析工作流程,包括GlycoWorks  RapiFluor-MS N-Glycan Kit。此外,该公司新推出的ACQUITY UPLC糖蛋白BEHAmide300Å1.7μm色谱柱具有较大的孔径,可分离完整的糖蛋白。安捷伦还提供聚糖分析工具及其1290 Infinity II液相色谱系统,这是一种高端UHPLC系统,用于肽谱分析和聚糖分析,其中**高峰容量是**必要的,“Vad说。

未来可能在核壳颗粒以及研究和生物制药应用方面有进一步的技术发展。作为化学和生物学的交汇点,蛋白质的UHPLC有望多样化为一系列有趣的应用 - 请继续关注UHPLC技术的发展方向。