挑选完美的HPLC色谱柱

当然,这个过程的关键是专栏本身。但是有这么多类型,选择一个列可能会让人眼花缭乱。这些指南可以帮助您做出正确的选择。

分离模式

挑选色谱柱的**项任务是选择分离化学品。分离分子的方法有很  多种,**广泛使用的方法包括反相,正相,亲水相互作用,离子交换和尺寸排阻HPLC。还有不太常见和更专业的分离模式,例如特定的手性色谱,其使用手性固定相或流动相。

PerkinElmer的色谱技术负责人Jason Weisenseel表示,反相色谱柱常用于非极性或弱极性有机化合物,含有非极性固定相(如C18),通常与极性流动相配对。这种方法不应该用于蛋白质,Weisenseel警告说:“流动相,通常在低pH值下含有乙腈或甲醇,可能使蛋白质变性,从而导致人为的峰值或导致蛋白质聚集和色谱柱堵塞。”

Weisenseel说,正相HPLC-柱填料是极性物质,如二氧化硅,流动相是非极性的 - 是“与反相相反的”。它通常用于分离极性分子。

其他流行的模式包括用于分离离子化合物的离子交换HPLC和尺寸排阻色谱(SEC),它们根据分子的大小或形状分离分子。用户可能选择后者将蛋白质聚集体与蛋白质单体分离,但选择前者将磷酸化蛋白质从非磷酸化形式中分离出来,GE医疗生命科学研究和应用市场的科学家ÅkeDanielsson说。

列长

确定列类型后,请考虑其长度。理想长度在某种程度上取决于您的特定样品和分离模式。但是,一般的经验法则(和权衡)是较长的列需要更长的时间来运行,但产生更好的分离。关键是“选择能够在分辨率和分析时间之间取得良好平衡的色谱柱长度,” 赛默飞世尔科技公司的科学顾问Tony Edge说。Edge说,一个常见的错误就是使用了一种你以前在实验中熟悉的色谱柱,并将其应用于新型实验,而不考虑它是否合适。

根据Danielsson的说法,柱长(有时称为“床高”)对于根据大小分离蛋白质特别重要。“300毫米的床高是高分辨率蛋白质SEC的理想选择,”他说。“对于与蛋白质相关的其他分离模式,可以使用更短的色谱柱,例如大约50 mm的床高。”

柱粒子的大小和类型

HPLC柱床由球形功能颗粒构成,其直径通常为2**10μm。根据Weisenseel,标准HPLC系统**常见的尺寸为3和5μm。“对于更复杂的样品,通过使用3μm粒径色谱柱可以提高分离度,”他说。小于2μm的粒径用于超高效液相色谱(UHPLC),这是一种特殊形式的HPLC,其使用比HPLC更小的颗粒和更高的压力。

与HPLC中的所有内容一样,色谱柱属性代表了权衡。一般而言,较小的颗粒尺寸可提供更高的分离度 - 同时需要注意背压也更大,以便将流动相泵入更密集的色谱柱。毫不奇怪,“装有较小珠子的柱子更容易堵塞,”Danielsson说。

除珠粒尺寸外,用户通常可以选择制作珠粒的材料。流行的选择包括二氧化硅,羟基磷灰石和交联聚合物树脂。常见的疏水烷基链的长度如C4,C8和C18。通常,材料对目标分析物具有一定程度的选择性 - 并且这种选择对于优化分辨率是重要的。例如,C18更常用于分离肽或小分子,而C4更适合蛋白质。“选择性对分辨率的影响大于珠粒尺寸,”Danielsson说。“因此,通过改变选择性可以显着提高分辨率,”例如,通过在用于SEC的颗粒中使用不同的孔径或通过在离子交换色谱中使用“季胺配体代替DEAE [二乙基氨基乙基]”。

颗粒的化学性质也可以使蛋白质分离产生差异。Danielsson说,二氧化硅上的硅烷醇基团是一种常见的柱填充材料,可以非特异性地吸附蛋白质。表面包覆的二氧化硅可以缓解这种情况,但受损的颗粒仍然可以吸附蛋白质。此外,二氧化硅填料不能容忍蛋白质分离中经常使用的标准高pH值清洗方案,Danielsson补充说,“基于琼脂糖的固定相表现出低的,非特异性的蛋白质吸附,并且耐受高pH值的色谱柱清洗方案。”

技术调整也产生了新的粒子类。一种新的二氧化硅基材料称为表面多孔颗粒(SPPs)或核 - 壳颗粒,通常只能从亚2μm的颗粒中获得分辨率,但没有更高的压力。通常,具有小于2μm的常规颗粒的HPLC柱将需要专门的UHPLC泵和/或系统来处理更高的背压。与传统的球形和全多孔二氧化硅颗粒不同,“SPP颗粒由涂有多孔硅胶壳的固体二氧化硅核心组成,”Weisenseel说。“这些颗粒的优势在于它们表现出的效率就像亚2微米颗粒,颗粒尺寸从2.6微米及以上,但工作温度略高于背压的一半。”

吞吐量

如果吞吐量是个问题,请注意色谱柱设计。“使用较短的色谱柱会缩短总分析时间,但也会影响分离度,”Edge说。对于高分辨率SEC分离,建议使用300毫米色谱柱,但Danielsson可以通过使用150毫米色谱柱进行筛选来提高总体通量。

尽管如此,HPLC通常不是分离研究的瓶颈,Weisenseel指出 - 它是样品制备。“你可以节省样品制备以提高产量,但脏样品会导致更多的HPLC维护和停机时间,这也会对您的产量造成不利影响,”他说。“良好的样品制备是获得一致和可靠结果的关键因素。”**终,将**佳制备的样品与**合适的HPLC色谱柱相匹配将产生**高质量的结果。

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