2016年色谱法采购指南

当从溶液中分离蛋白质时,液相色谱  是**广泛使用的技术之一。该方法的优势来自于利用物理化学性质(例如大小,手性,疏水性,电荷或与特定配体结合),从异质溶液中特异性分选,浓缩,脱盐或纯化蛋白质的能力。通常包含在诸如细胞上清液或细菌裂解物的溶液中的这些分子通过通常含有珠子(称为树脂或介质并且通常称为“固相”)的柱,它们以不同但通常可预测的方式与它们相互作用。

实验室规模的蛋白质制备曾经主要在重力进料玻璃柱或自制低压泵驱动系统中进行。**近,研究人员采用了商业化的低中压快速蛋白质液相色谱(FPLC)仪器,该仪器能够以更大但受控的压力(更高速度)将溶液(“液相”)推入色谱柱。 ),也许利用自动化和模块化组件,如各种探测器。

生物柱市场相当分散,某些供应商在高压液相色谱(HPLC)和超高压液相色谱(UHPLC / UPLC)市场中的主导地位远远超过FPLC,反之亦然。系统必须设计成在选择色谱柱时能够**佳地工作。例如,FPLC / LPLC(低压液相色谱)色谱柱在FPLC / LPLC系统上效果**佳。厂商如安捷伦,Bio-Rad公司,立方生物技术公司,GE医疗集团生命科学,MilliporeSigma,QIAGEN,赛默飞世,沃特斯 许多其他工具提供商提供各种产品来满足研究人员的需求。

用于进行色谱分离的柱的特征是多种多样的。本指南重点介绍基于亲和力的介质,离子交换介质和其他介质,以及工作流程中用于为实验室规模研究准备蛋白质的色谱柱。通知这些选择的许多见解有助于确定哪种试剂**适合特定项目,也可以转化为按比例扩大的蛋白质纯化工作流程。

工作流程

色谱法可用于分析,定量和了解少量蛋白质的结构,对于此HPLC或UPLC是**系统。对于纯化,蛋白质不是作为工具研究的主题。在典型的实验室规模的蛋白质纯化中,研究人员可能希望制备数十或数百毫克的产品用于测定,作为试剂或用于其他一些研究需要。它更多的是纯化的简便性和速度,而不是**纯度或总产量:我能以多快的速度获取细菌和细胞培养等原始样品,并以我需要的量抽出我感兴趣的蛋白质?例如,实验室规模明显不同于试验或工艺规模,其中可以生产更大量的产品作为治疗剂。

科学家应该开始考虑如何在手上有粗细胞裂解液或上清液之前很长时间地净化蛋白质。如果它是一种重组蛋白,那么现在是时候设计一种亲和标签或融合蛋白来促进蛋白质的分离。这也是阶段,手中的氨基酸序列 - 甚**没有标签 - 当研究人员可以寻找属性来帮助确定**有效的媒体和策略时。例如,蛋白质的等电点(pl)与缓冲液的pH值相比,可以帮助确定阴离子交换柱或阳离子交换柱是否有用。类似地,在序列中发现疏水斑块的证据可能表明疏水相互作用色谱(HIC)的效用。

典型的纯化从某种亲和步骤开始,例如在蛋白G上运行上清液以提取抗体,或使用金属螯合柱捕获组氨酸标记的蛋白质。对于大多数天然蛋白质,这种亲和纯化不是一种选择,在这些情况下,研究人员可能会研究更传统的技术,如离子交换(IEX)色谱和HIC,也许随后是尺寸排阻色谱(SEC,又称凝胶过滤)。

“使用适当数量的介质使用正确的列,以正确的顺序执行这些分离步骤非常重要。”

这些步骤通常在纯化工作流程中顺序进行(并且有时组合),包括所谓的捕获,中间和抛光步骤。 从批量分离开始,随着工艺的进行精制纯化,亲和树脂和IEX(阴离子和阳离子交换剂)以及较小程度的HIC,完成大部分繁重的工作。 在大多数情况下,SEC保留用于抛光。

基于亲和力的媒体

亲和FPLC树脂通常由碱珠 - 琼脂糖组成,其衍生物是**常见的 - 附着有对目的蛋白具有特定特异性的官能团。

具有各种配体的珠子可商购获得。例如,GE的  “亲和色谱柱和培养基选择指南”拥有预填充柱和散装树脂,可以将蛋白质从白蛋白结合到纤连蛋白。(Bio-Rad  还提供在线指南,以帮助研究人员选择色谱柱和树脂)。

许多这些亲和树脂用于所谓的组特异性纯化,这意味着它们结合许多相关蛋白,例如某些激酶,蛋白酶或糖蛋白。这些培养基通常用于提取已经用生物素,多组氨酸,谷胱甘肽S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP)标记的蛋白质。

一些媒体特别识别免疫球蛋白的类别,亚类或片段; 例如,具有修饰的蛋白A的现代树脂在单一亲和步骤中可以产生大于95%的纯度。但研究人员还可以将自己的配体连接到具有活化官能团的介质上,如环氧化物,肼和胺。例如,选择的结合抗体可用于捕获柱上的相应抗原(类似于免疫沉淀),或固定化药物抑制剂可捕获其结合配偶体。相互作用通常是高度特异性的,但是洗脱可能发生在需要测试和优化以避免蛋白质变性的苛刻条件下。

结合和洗脱色谱通常可以按比例放大而不需要对基础培养基进行很多改变 - 这是可能转变为生产规模的项目的重要考虑因素。这提供了安心,因为如果研究人员分离出一种新的治疗剂或试剂,整个方案就不需要重新设计。同样重要的是要考虑这种放大是否具有商业可行性:树脂是否过于昂贵,或难以获得附着的抗体?根据这些问题的答案,研究人员可能希望在此过程的早期考虑更具可扩展性的替代方案。

因为蛋白质被选择性地结合,所以亲和色谱法的珠粒尺寸不如基于蛋白质大小进行分离 - 您很容易获得纯度,并且不需要关注分辨率。

捕获树脂倾向较大,部分是因为在加载所述样品通常是澄清的裂解物,充满了粘稠的蛋白质,这将可能阻塞从(比方说)10-由柱米米珠。

“亲和色谱法的一个优点是,只要树脂具有足够的能力吸附样品中的蛋白质,其余的只是流过,就可以加载到色谱柱上的样品体积几乎没有限制。 “

(结合能力通常由供应商以每毫升色谱介质的蛋白质毫克数提供。)

许多亲和柱可以通过重力运行,有些像用于拉下多组氨酸标记蛋白的金属螯合柱 - 可以快速且易于用于某些应用。重力柱可能无法提供作为压力驱动色谱柱的可重复性,也不能提供色谱图,但通常这些不是定制纯化的关注点。

实际上,亲和层析甚**不需要在典型的柱中进行。通常可以在旋转柱中运行小体积。并且磁珠可能是自动化大量纯化的良好选择。

离子交换介质

“与亲和柱一样高效,几乎总会有一些污染物出现在骑行中。”

因此,尽管**好尽量减少纯化步骤的数量 - 每个额外的步骤都有成本,但就产品产率而言,亲和纯化通常会在某种IEX之后作为抛光步骤。如果没有亲和树脂,离子交换可以作为纯化的初始步骤。IEX倾向于降低成本,提供更高的容量 - 这对于捕获步骤尤其重要 - 并且比根据尺寸分离更容易。

出于实际目的,IEX介质可分为两类:阳离子交换剂,其吸引带正电荷的分子;和阴离子交换剂,其结合带负电荷的分子。每个类别都包括强粘合剂和弱粘合剂。缓冲条件如盐浓度和pH用于进一步改变这些树脂的结合性质。

负责强阴离子交换或弱阳离子交换的官能团在制造商之间不会显着不同:例如,阳离子交换剂通常含有磺酰基或羧基,而阴离子交换剂具有季铵离子或叔胺或仲胺。基础树脂本身通常也有助于结合特征。

研究人员可能会开始使用较大的珠子穿过色谱柱,以免污染色谱柱,然后使用较小的珠子穿过色谱柱,或者使用带相反电荷的树脂进行第二个IEX步骤,或者甚**是HIC-作为抛光步。

HIC基本上是IEX的另一面。在HIC中,疏水性配体用于在高盐浓度下结合蛋白质表面上的疏水性贴剂。

在合适的条件下,较小的珠子可以提供更高的分辨率。但大多数人使用亲和力,IEX或HIC树脂不是出于这个原因而是作为抓斗柱。

混合模式或多模式媒体

混合模式或多模式树脂,包括更新的类别,正引起很大兴趣。它们将多种选择性质(例如IEX和HIC官能团)结合在相同的珠子上 - 通常在相同的配体上。研究人员无法准确预测其蛋白质如何与混合模式树脂的亲水和带电部分相互作用,因此使用这些树脂可能需要比单模树脂更优化。但这可能是值得的,因为调整条件可以使工艺污染物(样品中发现的其他蛋白质)和产品杂质(例如截短和小电荷变体)适合精细分离。

与此处描述的其他介质不同,混合模式配体倾向于在供应商之间显着不同,其中一种使用芳族,而另一种使用支链烃作为疏水性元素。还有许多其他专门的色谱树脂可用于FPLC(和重力)场地。举一个例子,Bio-Rad的陶瓷羟基磷灰石 - 其中CaPO4珠子作为官能团加倍 - 是阴离子和阳离子交换剂的组合,其作用可以通过pH和盐浓度来调节。

由于各种工具提供商提供了许多选项,因此在考虑多模式介质时,建议尽可能多地筛选树脂。这将帮助您确定哪种能够**佳地分离您的特定蛋白质。

大小排除媒体

正如介质名称所适用的那样,在SEC中,溶液中的蛋白质在树脂通过色谱柱时会在树脂中和树脂周围流动。较小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱,因为它们比较大的分子更大程度地进入并穿过珠子的孔隙。SEC  是分离具有较大分子量差异的蛋白质组的好方法,例如来自二聚体和聚集体的单体。它还可用于清洗,脱盐和交换样品中的缓冲液。对于可能需要高纯度的下游工艺,例如质谱法或结晶学,SEC通常用作抛光步骤。

在SEC媒体产品的情况下,许多供应商提供各种各样的产品,特别是珠子材料和孔径不同。例如,GE的新型Superdex™和Superose™增加系列SEC树脂的小珠粒尺寸 - 约10 m m - 以及非常窄的粒度分布可以作为FPLC和HPLC之间的桥梁,使研究人员能够分离蛋白质使用低压色谱系统进行分析级分辨率。

包起来

为了制备少量蛋白质用于从结晶学到ELISAs到抑制剂研究的下游应用,研究人员通常依靠使用低压到中压驱动的FPLC仪器进行色谱分析。

各种介质使用不同的物理化学性质来实现分离。亲和层析通常是优选的**线,因为它提供**具选择性的分离并因此提供**大纯度 - 如果可以获得结合目的蛋白的合适配体。当要纯化带电或疏水蛋白时,IEX,HIC和混合模式色谱是明显的下一个选择。然而,因为不同的分子可以共享相同的电荷或疏水性,所以可能需要多次迭代 - 通常在“相反方向”。SEC,当使用时,通常保留用于**终的抛光步骤。通常,多个柱串联使用以获得所需的纯度。

我们在准备本文时对以下内容进行了有益的讨论:Gurmil Gendeh(安捷伦),Maja Petkovic(AMSBIO),Jeff Habel(Bio-Rad),John Daicic(GE医疗和生命科学),Paul Lynch(赛默飞世尔科技), Michael Miley(北卡罗来纳大学教堂山分校)