为质谱需求选择最佳电离源

今天的质谱仪比以往更快,更复杂,更灵敏。然而,如果送入这些机器的分子没有充电,机器就像蝙蝠一样盲目。

这是因为质谱仪实际上并不测量分子的质量,而是测量其质荷比(m / z)。考虑到分子的m / z值及其电荷状态,研究人员可以计算质量,但要做到这一点,**先**对分子进行蒸发和电离。

“如果你没有电离,或者你不能电离,那么就不能进行质谱分析,”普渡大学化学教授,质谱**R. Graham Cooks说。当然,电离源自然是任何质谱设置的**组成部分。事实上,**关重要的是,两种**流行的生命科学电离技术ESI(电喷雾电离)和MALDI(基质辅助激光解吸电离)在2002年获得了诺贝尔化学奖。

ESI和MALDI彻底改变了生物质谱,特别是蛋白质组学,因为它们“软”:它们使生物分子电离而不会在生物分子中将它们粉碎成碎片。然而,它们并不是当今生命科学研究人员**可用的电离方法。有APCI和APPI,DESI和DART以及LAESI,CI和EI等。“这是与电离方法的交易,”西北大学生命科学的沃尔特和玛丽伊丽莎白玻璃教授Neil Kelleher说,“这是一种字母汤 - 很多新方法的缩写词。”

在某种程度上,这是因为研究人员还没有弄清楚如何克服两个基本问题:样品制备和电离效率。样品电离以及这些离子向质谱仪的传输是“质谱”过程中效率**低的部分,“ 沃特世质谱产品管理**主管Steve Smith说。库克指出,过去五年中已开发出数十种新的电离技术。“如果[现有方法]没有问题,那就不是真的。”幸运的是,电离方法的字母表汤具有足够的多样性来处理几乎任何类别的分子。

MALDI和ESI

质谱电离技术可以细分为几类。大多数与色谱方法接口,包括液相色谱(例如,ESI,nanoESI,APPI和APCI)和气相色谱(例如,EI和CI)。其他人处理基于表面的样品,其离线处理(例如,MALDI)或直接分析而无需制备,即原位(例如,DESI,DART和LAESI)。

MALDI(例如,可用于Bruker Daltonics的microflex™,autoflex™speed和ultrafleXtreme™系列仪器)**适合用于双向凝胶电泳(2DGE)工作流程,其中蛋白质斑点从凝胶中切除,加工并点样到MALDI板上进行MS分析。

在MALDI中,将样品与吸收紫外线的结晶基质材料(例如2,5-二羟基苯甲酸和α-氰基-4-羟基肉桂酸)混合,并点样到金属靶板上。然后将板插入MS仪器中,在那里将其置于真空中(尽管可以从MassTech获得大气压变体,AP / MALDI)并用UV激光器击打。基质吸收辐射,加热和挥发样品并同时电离。

通常,MALDI赋予蛋白质+1电荷(偶尔也会增加+2或+3),这既简化了下游分析又使其复杂化。一方面,质量计算是微不足道的,因为z为+1时m / z = m。但+1电荷也使得分析完整蛋白质变得更加困难,因为它们的大尺寸将其m / z值推到大多数质谱仪的“**佳点”之外。

Kelleher说,+1离子对碎片反应也不好,使得MALDI成为串联质谱应用(如翻译后修饰分析和肽测序)中更为强大的电离源。

相反,ESI为每个分子产生一系列带电物质:+ 2,+ 3,+ 4等。这种离子万花筒使质量分析变得复杂,但却极大地促进了串联质谱分析的工作。而且,由于它是一种基于液体的方法,ESI与生物样品分析中常用的色谱分离兼容,从超快速UPLC到低流量nanoLC。

Kelleher**近发表了一项研究,其中他使用自上而下的蛋白质组学(一种蛋白质被完整地分析而不是作为肽来研究它们的翻译后修饰的方法)来鉴定和表征由1,043个人类基因产生的约3,000种蛋白质种类。[1]该研究由一对**ESI驱动的质谱仪驱动,该质谱仪与“纳米毛细管反相液相色谱”系统相结合,包括Thermo Scientific 12-Tesla LTQ FT超傅里叶变换离子回旋共振MS和Thermo Scientific Orbitrap Elite。

位于加利福尼亚州拉霍亚的斯克里普斯研究所的质谱分析师约翰耶茨也赞成基于ESI的质谱,主要是Orbitraps。不过,他的实验室倾向于建立自己的低流量源,而不是使用现成的解决方案。“由于我们制作了自己的专栏,因此使用我们自己的来源比尝试适应商业专业更容易,”他说。

耶茨的实验室**近购买了一种新的Thermo Scientific Q Exactive,一种混合​​四极杆 - Orbitrap仪器。他说,该仪器具有高质量分辨率和准确度以及快速扫描速度,“正在吸烟”。

课堂问题

史密斯认为,选择电离源时要考虑的**变量是研究人员正在寻找的那种分子。“每种方法都适用于某种极性的分子,”他说。

安捷伦科技公司 LC-MS营销总监Keith Waddell说,ESI可以**有效地电离相对极性的分子,特别是蛋白质和多肽。(该公司提供定制形式的ESI,称为Agilent JetStream,它使用加热的氮气浓缩并将电喷雾引导到MS进样口,将灵敏度提高5到10倍,Waddell说。)

对于极性较小的代谢物和其他化合物,如类固醇,研究人员可以考虑ESI变体,如APCI(大气压化学电离)和APPI(大气压光电离)。APCI使用离子分子反应来赋予电荷,而APPI使用光能来做同样的事情。

沃特世提供称为ESCI的双模电离源作为其质谱的标准组件,可在ESI和APCI模式之间快速交替。

Waddell说,对于高度非极性分子,研究人员应该考虑使用基于气相色谱(GC)的方法。GC**常采用两种电离方法之一:EI(电子碰撞)或CI(化学电离)。Waddell表示,在EI中,分子通过与加热灯丝产生的电子碰撞而被电离,通常通过“切断电子”并产生正电荷。CI做同样的事情,但是在气体存在的情况下气体变得带电; 与气体离子的碰撞反而使样品电离。

基于表面的环境电离

根据Cooks的说法,今天生物质谱中的一个**问题是样品制备。“质谱分析师不会把时间花在仪器上的样品上,他们把大部分时间花在色谱上,”他说。

如果研究人员对完全不同类别的分子感兴趣,尤其如此,因为用于糖类的提取方法不会捕获脂质。Cooks说,许多研究人员更愿意直接分析样品 - 也就是说,在没有所有样品制备和色谱杂技的情况下读取它们的分子谱。“简而言之,人们的愿望就是希望在原位进行质谱分析,”他说。

进入环境电离方法,使研究人员能够通过基本上从表面喷射离子,在很少或没有样品制备的情况下分析生物样品的化学成分。

根据库克斯的说法,过去五年左右的文献中已经描述了大约40种基于表面的环境电离方法,其中有4种已经商业化。其中一个由Cooks和同事开发,是DESI(解吸电喷雾电离)。

由Prosolia商业化的AB Sciex,Agilent Technologies,Bruker Daltonics,Leco,Thermo Scientific和Waters的仪器,DESI基本上将一束溶剂引导到载玻片上的组织样品上。当溶剂汇集时,它会提取样品中的一些分子组分,然后在随后的溶剂冲击下溅入MS进样口,产生电喷雾。

根据Cooks的说法,环境界面方法可以采用两种方式之一:“即取即拍”和MS成像。在前一种情况下,目标是对样品的分子谱进行快照,例如,测试食品样品中的污染物; 在后者中,研究人员在样本的各个点(即逐个像素)收集光谱。

MS成像的优势在于,研究人员可以生成一种样本分子组成的空间分辨图或图像,而不是简单地量化样本中各种化合物的大量丰度。范德比尔特大学质谱**理查德卡普里奥利完善了MALDI作为成像电离方法的使用,将得到的图像与数字图像的红/绿/蓝通道进行了比较,除了在这种情况下,每个“通道”对应于单一代谢物。[2]

Cooks说,环境电离方法的一个缺点是灵敏度:由于没有样品制备和富集,感兴趣的分子可能会在由更丰富但不相关的化合物产生的信号中丢失。此外,他说,离子抑制,其中一个分子抑制另一个分子的电离(从而限制灵敏度)在这些实验中可能特别成问题。

MALDI成像实际上不是环境方法,因为它发生在真空中并且需要样品制备。然而,它是一种替代的补充成像方法。Kelleher**近开始在他的自上而下的工作中使用这种方法(其中MALDI基质喷洒在MALDI靶板上的组织切片之上),使用MALDI成像对潜在生物标记分子进行**表面分析,然后进行更详细的“研磨和发现”基于ESI MS的分析,以实际详细描述这些蛋白质。

“自上而下的蛋白质组学与基于MALDI的成像之间存在良好的联系,”凯莱赫指出。“当人们进行MALDI成像时,他们经常进行直接分析,自上而下 - 他们不会消化。”

另一种**近引入的成像方法是LAESI(激光烧蚀电喷雾电离),由Protea Biosciences商业化为LAESI DP-1000电离系统。LAESI由乔治华盛顿大学的Akos Vertes开发,使用中红外激光(2,940 nm)激发水中的OH键,作为一种内源基质。气相颗粒由样品烧蚀产生,然后通过与电喷雾电离羽流的相互作用电离,所有这些都在环境压力下进行。

Protea Biosciences副总裁兼总经理Alessandro Baldi表示,与MALDI成像相比,这种方法的优势在于它不需要矩阵,简化了实验并生成更清晰的光谱,特别是在低m / z范围内。它也产生多电荷离子,ESI也是如此。但也许**重要的是,他说,LAESI允许研究人员通过反复挖掘样本并重新分析它来获取三维分子谱。

“LAESI可以划伤表面然后再深入,”Baldi说。“因此,看到表面上的内容与生物实体内部的内容之间存在差异。这可以直接在活细胞上进行。“

Baldi说,该技术产生的像素直径约为200微米,深度约为50微米。LAESI DP-1000被“科学家 ”杂志评为2011年十大创新之一[3],售价约25万美元。

在你购买之前

从各方面来看,安装新的电离源相对简单 - 拆卸和安装一些螺栓,以及电气和气体连接。

“这些是可以互换的,”Thermo Scientific的色谱和质谱产品研发副总裁Iain Mylchreest说。“通常它们是小型'源外壳'或探头,用于固定在仪器前部。没有人需要任何形式的服务干预。例如,从ESI切换到APCI可能需要几分钟。“

Waddell表示,对于大多数标准来源(例如APCI和APPI),预计支付的费用不到30,000美元左右。第三方来源可能会花费更多,但更大的问题是物理兼容性:仪器架构因供应商和仪器类别而异(例如,离子阱,飞行时间(TOF),四极杆),因此您需要制作确保您所需的离子源可以与实验室中的仪器连接。

如果您需要在未来几年购买另一个电离源,也不要感到惊讶。随着研究重点的改变,你总会发现自己正在研究一类新的分子,这些分子对你手头的技术反应不佳。

“那里没有通用的电离技术,”Mylchreest说。

 

参考

[1] Tran,JC等,“使用自上而下的蛋白质组学在发现模式中绘制完整的蛋白质异构体”,Nature,480:254-8,2011。

[2] Perkel,JM,“群众奇观”,“ 科学家”,23(3):61,2009年3月。

[3] 科学家工作人员,“2011年十大创新”,“ 科学家”,2012年1月。

 

本页顶部的图像是Thermo Fisher的Q Exactive。

 

编者注:文章“ESI与MALDI用于蛋白质表征质谱”(2007年5月8日)已经更新了当前的文章。